BEAUGÉ , Luis Jefe Laboratorio Investigador CONICET
Elso - BerberiÁn, Graciela Investigadora CONICET	Bollo, MARIANA Investigadora CONICET	SIRAVEGNA, Myriam Técnica Principal CONICET
FORCATO, DIEGO POSTDOC ANPCyT		CENTANNI, Claudia Becaria CONICET

 

INTERACCIÓN DEL INTERCAMBIADOR Na⁺/Ca²⁺ DE CELULAS EXCITABLES CON LIGANDOS REGULADORES

El plan propone explorar los mecanismos de regulación del intercambiador Na⁺/Ca²⁺ en nervio de calamar (NXCSQ1) y corazón bovino (NCX1). La elección obedece al hecho que si bien en ambos  el efecto final de los agentes reguladores parece ser sobre el asa citoplasmática mayor donde está el sitio regulador para Ca²⁺_i, las vías metabólicas muestran apreciables diferencias. El Plan está dividido  en tres subproyectos:

(1) Regulación del intercambio Na⁺/Ca²⁺ por MgATP, fosfoinosítidos y fosfágenos: El objetivo es investigar los procesos bioquímicos asociados a la regulación del intercambiador. Específicamente se propone individualizar los mecanismos y las enzimas involucradas en la regulación por ATP, ATP-g-S y poli-fosfoinosítidos en NCX1 y MgATP y fosfoarginina en NCXSQ1. Usando vesículas de membrana plasmática se estudiarán en paralelo transporte de iones y reacciones bioquímicas asociadas incluyendo quinasas y fosfatasas del ciclo de fosfoinositídos (NCX1). En NCXSQ1 se identificará y caracterizará el factor citosólico requerido para el efecto de MgATP. Por último se identificarán estructuras de membrana que son fosforiladas en estos procesos.

(2) Cambios estructurales de la molécula del intercambiador Na⁺/Ca²⁺ durante la interacción con ligandos reguladores: El objetivo es usar medidas de fluorescencia para obtener información sobre la estructura de las regiones citoplasmáticas de NCXSQ1 y NCX1 y sus cambios por interacción con ligandos reguladores. Específicamente se estudiarán en regiones “nativas” y  “modificadas” por mutaciones puntuales regiones conocidas de unión de ligandos (XIP y Ca²⁺) y aun desconocidas (unión de Na⁺ y de H⁺, PA). Los experimentos incluyen estudios de conformaciones (fluorescencia) “básicas” en ausencia y presencia de Ca²⁺ iónico,  cambios en función de la [Ca²⁺], efectos de inhibidores (Na⁺, H⁺ y XIP) y estimuladores: Ca²⁺ y PtdIns4,5-P₂, y phosphoarginina y MgATP. Por último se expresarán intercambiadores en levaduras (Pichia pastoris) para disponer de material para su purificación y caracterización.

(3) Dinámica de los cambios en la conformación del intercambiador Na⁺/Ca²⁺ asociados al transporte: El objetivo general es investigar cambios conformacionales en la proteína de NCXSQ1 y NCX1. Para ello se utilizarán oocitos de Xenopus que expresan el intercambiador a estudiar. Los objetivos específicos son el estudio de dos modalidades de operación del intercambiador (i) Na⁺_o-Ca²⁺_i (anterógrada) y (ii) Ca²⁺_o-Na⁺_i (retrógrada o reversa). El modo reverso tiene una velocidad máxima mucho menor que el anterógrado, probablemente debido a que el paso limitante es la entrada de Ca²⁺. La construcción y expresión de transportadores nativos, libres de cisteínas extracelulares y con cisteínas adicionadas se está llevando a cabo exitosamente en nuestro laboratorio.

 

Berberian, G. Bollo, M., Montich, G. Roberts, G. DeGiorgis, J. DiPolo, R. and L. Beauge. A novel lipid binding protein is a factor required for MgATP stimulation of the squid nerve Na+/Ca2+ exchanger. Biochim. Biophys. Acta 2009,1788:1255-1262.

Berberian, G. Forcato, D. and L. Beauge. Key role of a PtdIns-4,5-P2 micro domain in ionic regulation of the mammalian heart Na+/Ca2+ exchanger. Mini-review- Cell Calcium, 2009, 45:546-553.

D. Raimunda, M. Bollo, L. Beaugé and G- Berberián- Squid nerve Na/Ca exchanger expressed in Saccharomyces cerevisiae: Up-regulation by a phosphorylated cytosolic protein (ReP1-NCXSQ) is identical to that of native exchanger in situ. Cell Calcium, 2009, 45:499-508.

In the squid axon Na(+)/Ca (2+) exchanger the state of the Ca(i)-regulatory site influences the affinities of the intra- and extracellular transport sites for Na(+) and Ca (2+). Dipolo, R., Beaugé, L. Pflugers Arch. 2008 Jun;456(3):623-33. Epub 2008 Jan 3.

Electrofused giant protoplasts of Saccharomyces cerevisiae as a novel system for electrophysiological studies on membrane proteins. Terpitz, U., Raimunda, D., Westhoff, M., Sukhorukov, V.L., Beaugé, L., Bamberg, E., Zimmermann, D. Biochim. Biophys. Acta. 2008 Apr 1 [Epub ahead of print].

Dual effect of Nai+ on Ca2+ influx through the Na+/Ca2+ exchanger in dialyzed squid axons. Experimental data confirming the validity of the squid axon kinetic model. L. Beauge and R. DiPolo. Am J Physiol Cell Physiol, January 1, 2008; 294(1): C118 - C125.

Maximal Ca 2+ i- regulatory site affinity of bovine heart Na +/Ca 2+ exchanger requires simultaneous de-protonation and PtdIns-4,5-P2 binding. Velia Posada, Luis Beaugé and Graciela Berberián. Biol. Chem.388: 281-288, 2007.

Some biochemical properties of the up-regulation by MgATP and phosphoarginine of the squid nerve Na +/Ca 2+ exchanger. Berberián, G.; DiPolo, R., and L. Beaugé. Publicación por invitacion, Ann. N.Y.Acad. Sci. 1099, 152-165, 2007.

In bovine heart Na+/Ca2+ exchanger maximal Ca2+i  affinity requiers simultaneously high pHi and PtdIns-4,5-P2 binding to the carrier. Velia Posada, Luis Beaugé and Graciela Berberián. Ann. N.Y.Acad. Sci.,1099, 2007 (Short paper)

DiPolo, R., Berbeirán G., Rojas, H., Raimunda, D., Delgado, D. and Beaugé, L. Ionic interactions with the Sodium-Calcium exchanger. Modulation by ATP. Physiological Mini-Reviews- Vol.2, Nº 12, 2007 (On line Journal- Por invitación).

Sodium/Calcium Exchanger: Influence of Metabolic Regulation on Ion Carrier Interactions. Reinaldo Dipolo and Luis Beaugé. Physiol. Rev. 86: 155-203, 2006; doi:10.1152/physrev.00018.2005.

SEA- 0400, a potent inhibitor of the Na +/Ca 2+ exchanger, as a tool to study exchanger. Beaugé L,  and R. DiPolo, Am J Physiol Cell Physiol.2005; 288: 1374-1380.

Regulación metabólica del intercambio Na/Ca de cerebro. G. Berberián y  G. Roberts- Expertos invitados, SIIC-Salud, publicación on line, primera edición 17 de Mayo de 2005. http://www.siicsalud.com/des/des043/05510003.htm         

The enzyme H-ATPasa of superior plants: a model for the comparative study of the type "P" ATPasas”. Roberts, G., Berberián, G and Beaugé, L. Rev Fac Cien Med Univ Nac Cordoba, 61(1):54-60,  2004.

The phosphoinositides in the regulation of mammalian heart Na/Ca exchanger”.  G. Berberián, G. Roberts and L. Beaugé- Mini-review- Current Topics in Biochem. Res. , 6: 76-80, 2004.

Phosphoarginine regulation of the squid nerve Na +/Ca 2+ exchanger: metabolic pathway and exchanger-ligand interactions different from those seen with ATP, DiPolo, R., Berberián, G. and Beaugé, L., J. Physiol., 554, 387-401, 2004.